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细胞培养实战指南：如何做好细胞实验？

点击次数：11202 发布时间：2023/8/8 15:37:39

细胞是生物体的基本结构和功能单位。

细胞培养是在人工环境下，将细胞种植或培养在培养皿或培养瓶中，提供适当的培养基和条件，使细胞能够在体外持续生长和繁殖的过程。

细胞培养实验中，有一些细节，对于高效地完成实验十分重要。本期内

容，盘点细胞实验“实战”过程中的关键点。

实验前准备

1、明确细胞身份

在实验正式开始前，需要根据实验目的，确定所需的细胞系。不同的细胞系在形态、生理、代谢和功能等方面有很大的差异。选择适合研究目的的细胞系可以增加实验的准确性和可靠性。

选择来源靠谱的细胞系（细胞类型、细胞来源、细胞代数等信息），根据不同细胞来源，寻找相应的细胞培养资料，明确培养基种类、培养物添加量、培养条件（温度、湿度、二氧化碳浓度）等。

2、实验室环境清洁

在细胞实验开始前，需要对细胞培养环境进行清洁消毒甚至是灭菌处理。仪器、培养室墙壁与地面、培养室空间都应采取对应的清洁措施。

3、准备实验材料

选择高品质的实验耗材与试剂，尽可能选择无菌化处理过后的，若非无菌级，则需自行灭菌后才可用于细胞培养。

胎牛血清是许多细胞培养实验中一种重要的添加物。提供对维持细胞指数生长的激素，基础培养基中没有或量很少的营养物，以及主要的低分子营养物。还能够提供结合蛋白，能识别维生素、脂类、金属和其他激素等，能结合或调节它们所结合的物质活力。

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实验过程

细胞复苏

——液氮中取出的细胞，待液氮挥发后，马上将细胞冻存管置于37℃水浴中轻轻摇动使快速融化（尽量控制在2min内，时间过长了可能会影响细胞的状态）。在解冻时，冻存管瓶口尽量控制在水面以上。

——解冻后，将冻存管转移到无菌操作台，75%酒精擦拭冻存管外部。

——将细胞悬液转移至，装有37℃预热的培养基离心管中，800-1000rpm离心3-5分钟，弃上清。

——重新加入经预热培养基重悬细胞，以适宜密度，一般约为(3~5)×10^5个/ml密度接种到培养器皿（直径10cm）中。放到37℃孵育，第二天显微镜下观察细胞的情况。

细胞传代

——用移液器吸取并丢弃使用过的细胞培养基（不要直接倒掉，避免瓶口残留导致易污染），并用PBS缓慢冲洗细胞2次。

——以直径10cm的培养皿为例，向培养皿中加入500μl胰蛋白酶-EDTA（根据各细胞的使用说明，选择合适的浓度）消化液，轻轻摇动培养皿，使消化液流遍所有细胞表面，放到37 ℃ 孵育（一般2分钟左右即可）。镜下观察，发现胞质回缩、细胞间隙增大，倾斜培养瓶时细胞层能自然流即可终止，此时应加入2-3ml含血清的完全培养液终止消化（细胞的解离时间标准可能偏差，根据细胞来源确定，有些细胞属于半贴壁，无需胰蛋白酶也可解离）。

——吸取所有培养皿内的液体，沿培养皿底部缓慢吹打，重复该动作2-3次，使所有细胞沿瓶底流下，再轻柔地把细胞吹打成单个悬液（吹打过程中应尽量避免气泡的产生）。

——把所有的细胞悬液转移到15ml离心管中，800-1000rpm离心3-5分钟后弃上清。

——加入培养基重悬成单细胞悬液。按实验所需的细胞量添加到新的培养皿中，将培养皿37 ℃ 孵育，每天观察细胞的贴壁情况。

注意：向培养皿加液体时，建议从与贴壁细胞层相对的容器一侧轻轻加入冲洗液，以避免搅动细胞层，前后摇晃容器数次，*后移弃冲洗液。若是悬浮细胞传代培养，过程中省消化步骤。

细胞冻存

——按照“细胞传代”中的步骤收集细胞。

——加入细胞冻存液（一般10%DMSO+对应细胞的培养基），重悬细胞，使细胞的终密度为(5~10)×10^5个/ml，移入细胞冻存管中。

——程序降温，更推荐使用程序降温盒。若手动进行降温，冻存的一般程序为降温速度1～2℃/ min；当温度达-25℃以下时，可将降温速度增加至5℃～10℃/min；到-100℃时，则可迅速浸入液氮中。

污染控制

1、设备的清洁与灭菌

在开始任何细胞培养实验之前，必须对所有设备、耗材和试剂进行灭菌处理，当然，我们推荐实验人员尽量选择商品化的无菌试剂。

灭菌方法包括高压灭菌、过滤、紫外线照射、乙醇喷洒或擦拭、消毒清洁试剂喷洒或擦拭等。